Prosedur Membuat Larutan Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram adalah suatu teknik pewarnaan sel bakteri yang ditemukan pertama kali pada tahun 1884 oleh seorang ahli mikrobiologi asal Denmark bernama Hans Christian Gram. Teknik ini menggunakan beberapa jenis pewarna dan larutan reagen-reagen khusus yang mampu membedakan 2 kelompok bakteri berdasarkan komposisi dinding selnya. Konsentrasi peptidoglikan yang tinggi (tebal) pada dinsing sel disebut kelompok bakteri Gram positif, sedangkan konsentrasi peptidoglikan yang rendah (tipis) pada dinding sel disebut kelompok bakteri Gram negatif.

{tocify} $title={Daftar isi}

A. Komposisi Larutan Pewarnaan Gram

Zat kimia pewarnaan Gram adalah Kristal Violet, Lugols Iodin, Etanol, dan Safranin. Kristal Violet adalah larutan kimia yang berperan sebagai pewarna utama untuk mewarnai struktur peptidoglikan dinding sel. Lugols Iodine adalah larutan mordant yang berperan sebagai penguat ikatan pewarnaan antara zat warna kristal violet dengan peptidoglikan bakteri. Etanol 98% digunakan sebagi agen penjernih warna (dekolorizer) untuk menghilangkan ikatan zat pewarna kristal violet dengan peptidoglikan. Sedangkan Safranin adalah larutan pewarna pembanding yang memiliki warna merah. Safranin akan berikatan dengan peptidoglikan setelah tidak ada pewarna kristal violet yang mengikat.

Kristal violet disebut juga sebagai larutan Gram A, lugols iodine disebut Gram B, alkohol disebut Gram C, dan Safranin disebut juga Gram D. Masing-masing larutan Gram tersebut mempunyai komposisi tertentu, diantaranya adalah sebagai berikut:

Reagen Gram	Komposisi
Pewarna Primer (Kristal violet)	Kristal Violet 2 g, Etil Alkohol (95%) 20 ml, Amonium Oksalat 0,8 g, Akuades Steril 100 ml
Larutan Mordant (Lugols iodine)	Potasium Iodin 2 g, Kristal Iodin 1 g, Akuades Steril 300 ml
Larutan Dekolorizer (Etil Alkohol)	Etanol 475 ml, Aseton 500 ml, Akuades 25 ml
Pewarna Sekunder (Safranin)	Safranin 2,5 g, Etanol (95%) 100 ml, Akuades steril 800 ml

B. Prosedur Membuat Larutan Pewarnaan Gram

Cara membuat masing-masing larutan Gram adalah sebagai berikut:

Kristal Violet

• Larutkan 2 gram Kristal Violet ke dalam 20 ml Etil Alkohol 95%.
• Larutkan secara terpisah 0,8 gram Amonium Oksalat ke dalam 80 ml akuades.
• Campurkan larutan pertama dengan larutan kedua hingga terlarut sempurna, tanpa meninggalkan gumpalan. Kemudian diamkan semalaman (18-24 Jam) pada suhu ruang (25°C).
• Saring larutan kristal violet dengan kertas saring.
• Masukkan larutan kristal violet yang sudah jadi dalam botol dan simpan pada suhu ruangan (25°C).

Lugols Iodine

• Tumbuk 1 gram kristal Iodin dan 2 gram Potasium Iodin dengan mortar hingga halus.
• Tambahkan 300 ml akuades ke dalam mortar dan aduk hingga terlarut.
• Masukkan larutan Lugols Iodine yang telah jadi ke dalam botol yang dibungkus dengan alumunium foil agar terhindar dari cahaya.

Etanol (Dekolorizer)

• Campurkan 25 ml akuades dengan 475 ml etanol (etil alkohol) atau methanol (metil alkohol) (dapat dipilih salah satu).
• Masukkan larutan ke dalam botol berkapasitas 1 Liter.
• Tambahkan 500 ml aseton ke dalam botol dan campurkan dengan membolak-balikkan botol secara merata.
• Simpan botol pada suhu ruangan (25°C) dan jauhkan dari sumber api.
• Note: volume larutan dekolorizer (etanol) yang akan dibuat dapat disesuaikan sesuai kebutuhan, berdasarkan perbandingan antara akuades : etanol : aseton = 1:19:20 v/v.

Safranin

• Larutkan 2,5 gram safranin ke dalam 100 ml etil alkohol 95% hingga tercampur sempurna.
• Tambahkan 900 ml akuades ke dalam larutan.
• Simpan larutan pada suhu ruangan.

C. Sumber & Referensi

• fda.gov
• Nam Sun Wang. CELL DIFFERENTIATION BY GRAM'S STAIN. Department of Chemical & Biomolecular Engineering University of Maryland. umd.edu.
• Nisha Rijal. 2022. Preparation of Gram stain Reagents. microbeonline.com/preparation-gram-stain-reagents.

Follow

MicrobeHolic Situs berbagi ilmu Biologi dan Mikrobiologi. Silahkan follow situs ini untuk mendapatkan update terbaru.

Share this post